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基本信息
產(chǎn)品編號(hào) 70101
中文名稱(chēng) α-Gal抗原定量檢測(cè)試劑盒(標(biāo)準(zhǔn)方法)
英文名稱(chēng) α-Gal antigen quantitative detection Kit(standard method)
產(chǎn)品價(jià)格(元) 9220.00

產(chǎn)品詳情

α-Gal抗原定量檢測(cè)試劑盒(標(biāo)準(zhǔn)方法)說(shuō)明書(shū)
 
使用目的:
本試劑盒適用于動(dòng)物源性醫(yī)療器械、動(dòng)物組織及其衍生物等相關(guān)樣本中α半乳糖基抗原(α-Gal)含量的定量檢測(cè)。
 
試劑盒原理:
本試劑盒完全按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 動(dòng)物源性支架材料殘留α-Gal抗原檢測(cè)》中給出的方法,利用特異性抗-Gal抗體的酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法(競(jìng)爭(zhēng)性ELISA或者ELISA抑制法)。即:在保證抗原抗體反應(yīng)物中特異性抗體過(guò)量的前提下,首先標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品及試驗(yàn)樣品的α-Gal抗原與特異性抗體反應(yīng)(消耗部分抗體);然后用人工合成的Gal抗原(Gal-BSA)作為固相抗原,通過(guò)ELISA方法檢測(cè)第一次反應(yīng)后上清液中的剩余抗體;進(jìn)而可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算待測(cè)物中的α-Gal抗原含量。
 
試劑盒組成:
試劑盒A (2~8℃保存)                    
1 Gal抗原包被板 8孔×12條
2 裂解液 50 ml×1瓶
3 抗體Ⅰ稀釋液 12ml×1瓶
4 酶標(biāo)試劑 12 ml×1瓶
5 濃縮洗滌液 50 ml×1瓶
6 顯色液A液 8 ml×1瓶
7 顯色液B液 8 ml×1瓶
8 終止液 8 ml×1瓶
9 覆板貼膜 3張
10 說(shuō)明書(shū) 1份
11 自封袋 1個(gè)

試劑盒-20℃保存
 
1 苯甲基磺酰氟(PMSF) 0.9 ml×1瓶
2 Gal-BSA標(biāo)準(zhǔn)品 120μl×1瓶
3 抗體Ⅰ(特異性抗-Gal抗體) 0.6ml×1瓶
 


 
自備材料:
1.      Gal抗原陰/陽(yáng)性參考品為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì), 須自行到中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)買(mǎi)。
  1. 2ml或5ml離心管;
  2. 移液器及吸頭。
 
樣本要求:
樣品采集后,盡早進(jìn)行樣本制備并檢測(cè),若不能及時(shí)進(jìn)行檢測(cè),須在-20℃保存并避免反復(fù)凍融。
 
安全性:
  1. 避免接觸試劑盒中的顯色液A液、B液以及終止液,一旦接觸需立即用大量水沖洗;
  2. 試驗(yàn)過(guò)程中不要吸煙、飲食以及使用化妝品;
  3. 不要用嘴吸試劑盒中的任何液體。
 
 
試劑盒的保存和使用注意事項(xiàng):
1.       試劑盒分A和B兩盒,A盒各組分需要在2~8℃保存,B盒各組分需要在-20℃保存,使用前恢復(fù)到室溫并充分混合均勻;
2.       根據(jù)樣品的量決定所需要的板子條數(shù),建議樣品做3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,并密封保存,防止受潮;
3.       未用完的試劑,應(yīng)包裝好,避免不同批號(hào)混用,同時(shí)避免長(zhǎng)期打開(kāi)蓋子放置;
4.       試劑盒過(guò)保質(zhì)期不要使用;
5.       顯色液B液對(duì)光敏感,避免長(zhǎng)期暴露于陽(yáng)光下,避免用手接觸,實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)讀取OD值;
6.       裂解液在使用前需要按照裂解液體積1%的量加入苯甲基磺酰氟(以下簡(jiǎn)稱(chēng)PMSF),現(xiàn)用現(xiàn)加,加入PMSF的裂解液要一次用完,不可存留再用;
7.       抗體Ⅰ需要使用抗體Ⅰ稀釋液進(jìn)行20倍稀釋后使用;
8.       洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水;
9.       加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有孔反應(yīng)時(shí)間一樣;
10.   按照說(shuō)明書(shū)標(biāo)示的時(shí)間以及順序進(jìn)行操作。
 
樣品預(yù)處理:
1.  Gal抗原陰/陽(yáng)性參考品制備:精確稱(chēng)取一定量的陰性/陽(yáng)性參考品,置于2ml或5ml無(wú)菌離心管內(nèi),加入裂解液(裂解液在使用前需要加入1%PMSF),制成樣品濃度為2mg/ml混懸液,在室溫放置3h后,4000r/min、離心10min,取上清液備用。
2.  標(biāo)準(zhǔn)品制備:在陰性參考品樣品中加入裂解液(裂解液在使用前需要加入1%PMSF),配制成2mg/ml作為陰性基質(zhì)液,在其中加入Gal-BSA標(biāo)準(zhǔn)品,使其終濃度為 4μg/ml,之后依次用等量陰性基質(zhì)液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)嫌?jì)7個(gè)系列濃度。
3.  檢測(cè)樣品的制備:精確稱(chēng)取試驗(yàn)樣品(2 mg~10 mg)置于2ml或 5 ml無(wú)菌離心管內(nèi),若為固態(tài)塊狀或片狀試驗(yàn)樣品,則用無(wú)菌眼科剪將樣品剪裁成細(xì)小碎塊。加入裂解液到一定濃度(裂解液在使用前需要加入1%PMSF),濃度根據(jù)樣品大致含α-Gal抗原量決定,低溫勻漿2 min~10 min,至樣品全部粉碎,無(wú)肉眼可見(jiàn)明顯顆粒,形成均勻組織勻漿。室溫放置3 h至樣品全部裂解,4000r/min離心10min,取上清液備用。
 
樣品與抗體Ⅰ反應(yīng)
將制備好的樣品與抗體Ⅰ(使用抗體Ⅰ稀釋液將抗體Ⅰ進(jìn)行20倍稀釋?zhuān)┑润w積混合(標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為2 μg/ml,1 μg/ml,0.5 μg/ml,0.25 μg/ml,0.125 μg/ml,0.0625 μg/ml,0.03125 μg/ml;檢測(cè)樣品的終濃度減半)后,在37℃輕微震蕩溫育2h,之后轉(zhuǎn)4℃過(guò)夜。使用前在14000×g,4℃,離心30min后,取上清使用。
 
試劑盒操作過(guò)程(剩余抗體I的檢測(cè)):
1.  配液:將濃縮洗滌液用蒸餾水或純化水20倍稀釋。
2.  加樣:分別在相應(yīng)孔中加入抗體Ⅰ反應(yīng)后的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品上清液各100 μl。
3.  溫育:用封板膜封板后,置37℃震蕩溫育60分鐘。
4.  洗板:小心揭掉封板膜,用排槍或其他移液器吸干樣品,在每孔中注入洗液200 μl,浸泡30 s,棄去板孔中洗液,洗滌5遍,最后一次盡量扣干。
5.  加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑100 μl。
6.  溫育:用封板膜封板后,置37℃震蕩溫育30分鐘。
7.  洗板:小心揭掉封板膜,用排槍或其他移液器吸干樣品,在每孔中注入洗液200 μl,浸泡30 s,棄去板孔中洗液,洗滌5遍,最后一次盡量扣干。
8.  顯色:將顯色液A液和顯色液B液等體積混合均勻,每孔加入混合好的顯色液100 μl,輕輕振蕩混勻,37℃避光顯色30分鐘。
9.  測(cè)定:取出酶標(biāo)板,迅速在每孔加終止液50 μl,輕輕振蕩混勻后,立即測(cè)定結(jié)果。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
 
檢測(cè)結(jié)果計(jì)算與分析:
1.  根據(jù)測(cè)定的吸光度值,計(jì)算各樣品的抗體I結(jié)合抑制率。
        IR = {(M-b)-(T-b)}/(M-b)×100 %
式中:
IR --抗體I結(jié)合抑制率(Inhibition rate),%;
M  --抗體I/陰性基質(zhì)液反應(yīng)OD值均值(100 %反應(yīng));
T  --試驗(yàn)樣品反應(yīng)(Test sample)OD值均值(剩余抗體I的反應(yīng));
b  --裂解液反應(yīng)(blank)OD值均值。
2.  以標(biāo)準(zhǔn)品樣品系列稀釋濃度為橫坐標(biāo)(X),抗體I結(jié)合抑制率(小數(shù))為縱坐標(biāo)繪制最佳曲線(xiàn)方程,推薦使用對(duì)數(shù)方程,或者四參數(shù)方程軟件,獲得四參數(shù)方程,直接把待測(cè)樣品的抗體I結(jié)合抑制率代入方程式,計(jì)算待測(cè)樣品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品(Gal-BSA標(biāo)準(zhǔn)品)的量,再乘以1.82×1014/μg(Gal-BSA),計(jì)算單位質(zhì)量待測(cè)樣品的Gal抗原含量。
 
試劑盒性能:
1.  靈敏度:最小的檢測(cè)濃度≥標(biāo)準(zhǔn)品的第5個(gè)倍比系列稀釋濃度。樣品線(xiàn)性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為>0.950。
2.  特異性:Gal抗原陰性生物材料參考品不會(huì)檢出Gal抗原,陰性參考品的檢測(cè)OD值與裂解液對(duì)照孔的反應(yīng)OD值不存在顯著性差異。
3.  重復(fù)性:樣品檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)(CV)≤30%。
4.  檢測(cè)回收率:標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品的檢測(cè)回收率為80%~120%。
 
試劑盒局限性:
樣品前處理是影響最終檢測(cè)結(jié)果的重要因素,應(yīng)保證抗原的充分暴露。樣品中基質(zhì)的干擾不可避免,為非線(xiàn)性的。因此,需要盡可能保證標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品的組成與待檢測(cè)樣品的組成相同或者相近。
 
試劑盒有效期:
試劑盒有效期為一年。
 

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